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細胞冷凍保存

1. 注意事項 
1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài),約為80 – 90 %致密度。 
1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質,例如hybridoma 應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。 
1.3. 注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小體積分裝,4 oC 避光保存,勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽 
     滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。 
1.4. 冷凍保存之細胞濃度: 
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml,細胞濃度不要太高,某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。 
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。 
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106 cells/ml。 
1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 % DMSO,若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,以防止冷凍失敗。 
1.6. 冷凍方法: 
1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4 oC 10 分鐘---> -20 oC 30 分鐘---> -80 oC 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。 
1.6.2. 程序降溫:利用等速降溫機以–1 ~ -3 oC/分鐘之速度由室溫降至–120 oC,放在液氮槽vapor phase 長期儲存。
                 適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。 
2. 材料 
2.1. 生長良好之培養(yǎng)細胞 
2.2. 新鮮培養(yǎng)基 
2.3. DMSO (Sigma D-2650) 
2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 
2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 
2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片 
2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II) 
3. 步驟
3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細胞生長情形。 
3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中,最后濃度為5-10%,混合均勻,置于室溫下待用。 
3.3. 依細胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。 
3.4. 離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,混合均勻 分裝于已標示完全之冷凍保存管中,1 ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 
3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。 
3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中,再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL 
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